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Western Blotting|实验技术服务

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测序实验流程：
对于Western Blotting实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其*终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。
1.样品收集
1）培养的细胞
贴壁和悬浮细胞收集方式不同，细胞裂解液种类各异，推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解，煮沸即可。
2）动物组织
与细胞不同，组织块由于体积较大，须预先经破碎匀浆处理。
2．样品定量
样品电泳前需测定蛋白浓度，以便保证上样量一致，有利于后续定量或半定量分析。常用的蛋白质浓度测定方法有好多种，其灵敏度和所需时间不同，且不同的方**受不同干扰物质的影响，实验者可根据样品制备方法（裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等）自行选择。
注意事项：
a. 应尽量避免引入影响后续定量的杂蛋白（如细胞培养液、蛋白酶抑制剂等）及其他干扰物质；
b. 样品浓度应适中，1×SDS凝胶加样缓冲液建议用量：贴壁细胞按10cm2培养皿/0.1ml，悬浮细胞按5×106细胞/0.1ml比例加入；
c. SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要，浓度应控制在2-10%之间，并根据具体需要调整；
d. 制备好的样品可以在-20℃保存，但时间不宜过长，并避免反复冻融，否则蛋白会发生降解；
e. 内参对实验结果至关重要，应选择合适的内参。
Western印迹含一系列步骤，包括：
􀁺 用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。
􀁺 将胶上的蛋白转移到膜上。
􀁺 鉴定膜上特定蛋白。
下面将从理论和实践方面讨论Western印迹方法。
用1-D或2-D凝胶分离复杂蛋白质混合物
印迹前分离复杂蛋白质混合物的*常见方法是一维（1-D）SDS-PAGE电泳，它根据蛋白质的分子量进行分离。有时用非变性电泳分离天然蛋白质。尽管这种方法通常缺乏变性电泳的分辨率，但当蛋白须保留生物活性时非常有用。
二维（2-D）凝胶电泳用于分析细胞、组织、和体液蛋白质的组成，是现代蛋白质组学的关键技术。2-D免疫印迹可提供分子量和等电点信息，并可用于区分翻译后修饰产生的不同蛋白质形式。有些情况下只进行1-D电泳分离也可用免疫印迹对蛋白分型。

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