什么是内毒素？

内毒素（又名脂多糖、LPS 或脂质聚糖）是革兰氏阴性菌外膜的一部分，由脂质部分和多糖部分组成，后者由内核、外核和 O 抗原组成，通过共价键连接1.在动物中，内毒素的脂质部分（称为脂质A）通常引起免疫细胞表面由Toll样受体4复合物（TLR4 / MD2 / CD14）介导的强烈免疫反应2.这种免疫反应的不受控制的激活通常与炎症介质的产生有关。这可能导致毛细血管渗漏综合征，导致血管内皮层的损伤和扩张，心脏功能下降和体温升高（发烧）;通常称为致命性脓毒性休克.

为什么内毒素污染在实验室中很常见？

由于细菌广泛存在于自然界中，与植物和动物共存，因此内毒素无处不在。内毒素从死细菌中自然释放出来，或作为正常细菌生命周期的一部分以囊泡/水泡的形式释放.内毒素的关键特性之一是其高热稳定性;发现使用正常灭菌条件很难灭活/销毁。事实上，蒸汽灭菌在消除活微生物的同时，无意中增加了玻璃器皿上的内毒素水平4.在生化上，内毒素本质上是疏水性的，它们倾向于粘附在其他疏水材料上，例如常见的塑料实验室用品。由于这些特性，内毒素污染在实验室程序中很常见。美国和欧洲药典指南指出，要完全破坏内毒素，需要在250°C下进行30分钟的干式灭菌.

FDA对内毒素浓度的限制是什么？

发现人类对内毒素比其他动物更敏感。虽然每公斤体重 1 μg 内毒素的剂量会引起人类感染性休克，但小鼠可以耐受高出一千倍的剂量。由于细菌内毒素是*普遍的热原污染物，美国食品和药物管理局 （FDA） 对人用和兽用肠外用药和医疗器械的内毒素浓度设定了限制。内毒素水平以 EU/ml 为单位测量，其中 EU 代表内毒素单位。一个EU大约等于0.1至0.2 ng内毒素/ml溶液，具体取决于所使用的参考标准品;this is the amount of endotoxin present in 105 to 1010 bacteria。FDA指南指出，测试比较时应使用内毒素单位而不是重量，因为内毒素引起热原效应的效力取决于多种因素：多糖链长度、聚集、在生物体液中的溶解度、细菌来源、相关物质等。目前肠胃外给药药物中的USP内毒素限值为每小时5 EU/kg体重，鞘内给药为0.2 EU/kg。医疗器械的内毒素限值为 0.5 EU/ml 或 20 EU/器械，脑脊液接触器械的内毒素限值为 0.06 EU/ml 或 2.15 EU/器械.

什么是兔子热原测试？

1940 年代引入的兔热原测试在筛选用于验证肠外药物的水和溶液方面非常成功。然而，这种测试昂贵、耗时且不是很定量。在 1970 年代，基于观察到马蹄蟹 （Limulus polyphemus） 变形细胞裂解物在内毒素水平非常低的情况下会凝结，开发了一种体外测定方法。这被称为鲎变形细胞裂解物或鲎榴莲视频官网成人测定。鲎榴莲视频官网成人测定在1970年代获得FDA批准，用于测量与血液接触的肠外药物，设备和产品中的LPS.鲎榴莲视频官网成人测定法至少有三种形式，每种形式具有不同的灵敏度：1）鲎榴莲视频官网成人凝块法，2）鲎榴莲视频官网成人动力学比浊法，以及3）鲎榴莲视频官网成人显色法。前者可以检测低至 0.03 EU/ml 的内毒素，而后两种可以检测低至 0.01 EU/ml 的内毒素.

什么是低内毒素/脂多糖回收率 （LER/LLR）？

尽管鲎榴莲视频官网成人是一种强大的检测方法，可以检测极低水平的内毒素的存在，但*近，当发现产品或加工材料中可测量的内毒素浓度随着时间的推移（例如在储存期间）下降时，人们越来越担心，尽管样品可能在USP热原测试中保持热原性。这种现象被称为低内毒素/脂多糖回收率或 LER/LLR。结果表明，LER/LLR现象可能是由于药物辅料（如广泛使用的聚山梨酯和柠檬酸盐）或添加/污染的蛋白质掩盖了内毒素.

由于在一系列不同的样品基质中观察到了 LER，因此尚未解释 LER 的具体机制;尽管已经提出了许多假设。Chen和Vinther认为，螯合剂和聚山梨醇酯可以掩盖内毒素并形成LER/LLR复合物，该复合物抑制内毒素与其受体因子C的结合，而C因子是LAL反应所必需的12.然而，其他研究的结果并不支持任何特定的机制。在一项研究中，在低浓度表面活性剂（0.0001% v/v 聚山梨醇酯 20）下，鲎活性提高到约 180%。随着表面活性剂浓度的增加，鲎活性下降，在约0.0025% v/v聚山梨醇酯20时降至几乎为零。其他研究表明，内毒素和制剂在聚集、溶解和掩蔽方面存在相互作用。据报道，时间和温度也会对LER产生影响。据报道，LER 现象在室温下比在 2-8°C 下发生得更快，并且 7 天的孵育期足以确定药物是否表现出 LER。 当有机化合物（如柠檬酸盐、乙酸盐和 MES 缓冲液）包括苯甲脒（蛋白酶抑制剂）或 EDTA 或二甲基亚砜作为赋形剂存在于产品中时，也会报告 LER.

目前FDA对低内毒素/脂多糖回收的建议和指南是什么？

随着大量研究中药物制剂中的LER/LLR现象越来越明显，FDA开始关注药物和医疗器械中的LER/LLR，并提出了新的USP指南，尽管已经制定了旧的指南。USP 指南建议药品生产商应进行保温时间研究，以检测所有新药的 LER/LLR。保持时间研究应通过在未稀释的产品中加入已知量的内毒素来完成，然后在适当的储存条件下测量可检测内毒素随时间变化的浓度.内毒素浓度下降提示 LER。除了保温时间研究外，USP 还提出了一种新的参考标准 （RS），即来自表征为革兰氏阴性菌的孔的天然内毒素 （NOE）。使用 NOE 作为 RS 的原因在 USP 科学部**科学联络员 Radhakrishna S. Tirumalai 博士*近撰写的一篇评论中进行了详细描述.未来使用NOE进行LPS定量的原因非常周到：首先，天然内毒素是革兰氏阴性菌外膜的囊泡或“泡泡”。其次，由自然死亡细菌产生的细胞壁碎片是现实生活中的污染物，可能存在于药物原料、水系统、工艺样品和*终药品中。第三，化学提取的LPS（通常称为“内毒素”）在自然界中并不存在，并且在生化上与天然内毒素不同。第四，提取的LPS从细胞壁上剥离，将被吸收到表面，并在溶液中形成胶束和其他聚集体。第五，不同的产品配方和温度、pH值、盐、洗涤剂、螯合剂等因素也会对聚集有影响。显然，提取的 LPS 作为 RS 可能不合适，因为它在化学、生物学和结构上与天然革兰氏阴性细菌细胞壁片段不同。新的USP指南还包括对细菌菌株的建议，以及模拟“真实世界”内毒素污染的“NOE”的制备、储存和记录方法.

克服低内毒素/低脂多糖回收率的策略是什么？

已经提出了一些克服LER/LLR的策略。样品稀释至1/1000后，在内毒素测定中，添加的内毒素的回收率显著提高，以克服LER/LLR.在内毒素测定中，在用聚山梨酯 80、柠檬酸盐或磷酸钠配制的两种抗体中添加硫酸镁可减轻 LER/LLR.在一项研究中，据报道，冻融制度可以减轻 LER/LLR。其他研究表明，蛋白酶处理以揭示内毒素可减轻内毒素测定中的 LER.鉴于与不同产品和辅料的不同相互作用，可以想象，一种特定的策略并不适用于所有人，需要为每种产品制定策略.

结论：

由于内毒素含量丰富、热稳定性高且难以去除，因此建议采用两种通用策略来解决和缓解 LER/LLR 现象。**种策略是尽量减少各个层面的内毒素污染，即在产品中的材料、制造过程中涉及的所有过程中，防止制造过程中的生物负荷，并确保在相关工艺步骤中去除内毒素。其次，制定测试LER的策略，并开发克服LER/LLR的方法。

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